10X单细胞V(D)J免疫组库测序

　　T淋巴细胞（T cell）和B淋巴细胞（B cell）主要负责适应性免疫应答，其抗原识别主要依赖于T细胞受体（T cell recptor, TCR）和B细胞受体（B cell recptor, BCR），这两类细胞表面分子的共同特点是其多样性，可以识别多种多样的抗原分子。BCR的轻链和TCRβ链由V、D、J、C四个基因片段组成，BCR的重链和TCRα链由V、J、C三个基因片段组成，这些基因片段在遗传过程中发生重组、重排，组合成不同的形式，保证了受体多样性。

　　传统免疫组库研究方式局限性较大，10X Genomics新推出的“单细胞免疫谱分析”利用其微流控芯片制备单细胞体系，选择5'端接头的通用引物和免疫分子恒定区的巢式引物进行V(D)J富集，实现在单细胞水平，对成对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）进行全长测序，为免疫组库全面、系统的研究提供了高效的技术平台，对疾病发生、发展的分子机制研究有重要的意义。

样本类型

可实现成对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）的全长测序
精细到单细胞水平，能获得大量单细胞的免疫组库数据
大规模单细胞VDJ+表达谱测序，单个细胞成本大大降低

技术路线

细胞质检
单细胞分选
反转录
文库构建
上机测序
数据分析

分析内容

1. 测序数据质量评估	4. 特征分析（CDR3特征分析、V/J基因特征分析、V-J paired特征分析）
2. 比对与注释（样本基本信息结果统计、样本contig注释信息结果统计、样本Consensus序列注释信息结果统计）	5. 多样本分析（样本间Clonotype比较、Overlapping Clonotype聚类分析、Overlapping Clonotype差异分析）
3. Clonotype分型

样本类型

细胞悬液，组织、体液等（提供上门取样服务）

代表性文章

ElhamAzizi, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell, 2018,DOI: //doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.060

案例展示

单细胞测序揭示复杂的肿瘤微环境

1.研究背景
了解肿瘤微环境中的免疫细胞表型，对了解癌症进展和免疫疗法的机制是必不可少的。本研究从8名乳腺癌患者的肿瘤样本及配对的正常血液、乳腺和淋巴结样本中获得多个免疫细胞，开展单细胞RNA测序实验。之后，利用SEQC流程和“Biscuit”算法，对这些组织中的免疫细胞进行聚类和鉴定。

2.研究思路
本研究总共鉴定出83个不同的免疫细胞簇，包括38个T细胞簇、27个骨髓谱系细胞簇、9个B细胞簇和9个自然杀伤细胞簇。大多数的细胞簇（除了其中的10个）是不止一名患者所共有的，尽管在肿瘤样本中的表型往往不同。研究指出，部分T细胞在肿瘤和正常组织中都存在，不过细胞毒性T细胞在肿瘤中更丰富，Treg细胞也是如此。
在一系列后续实验中，研究人员利用10X Genomics的方法获得27,000多个T细胞的TCR-seq和RNA-seq配对数据并开展分析。比较了正常组织和乳腺癌组织的免疫组库，发现表型扩增往往发生在乳腺癌微环境中。
这些观察结果，以及免疫细胞的RNA-seq和TCR-seq数据集和全面的分析平台，将有助于研究人员更好地了解免疫细胞促进和延缓肿瘤生长背后的分子机制。

参考文献

ElhamAzizi, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell, 2018,DOI: //doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.060

结果展示

1.V-J paired特征分析
V-J paired直接反应出CDR3或免疫组库的变化，图中横坐标为V Gene，纵坐标为J Gene。颜色越深表示V-J paired丰度越高。

2.V/J基因特征分析
对CDR3 V/J基因序列长度分布情况进行统计，图中横坐标为CDR3(V Gene)碱基序列长度，纵坐标为对应的clonotype name频率，不同颜色表示不同V Gene，top10的V Gene用彩色表示，other（灰色部分）表示其他V Gene。

3.Clonotype分型
一个clonotype（克隆亚型）的定义为：一组唯一的CDR3核苷酸序列。Cell Ranger根据拼接得到的Consensus中的CDR3氨基酸序列进行Clonotype分型，其有效Barcode为该Clonotype的丰度。利用圈图展示免疫组库的top10 clonotype频率分布（clonality）。

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10X单细胞V(D)J免疫组库测序

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