ceRNA芯片

基因的转录后调控是一个十分复杂的精细调控网络。这其中，竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）调控机制最为引人关注：microRNA（miRNA）处在这个调控网络的中心，由于长非编码RNA分子通常富含miRNA结合位点，可以竞争性地结合miRNA，解除miRNA对其靶基因的抑制作用，进而调控基因的表达水平。在ceRNA机制中，circRNA和lncRNA因为常携带多个miRNA结合位点，是典型的ceRNA。阐释circRNA和lncRNA发挥的ceRNA调控机制，将帮助医学研究者深入理解疾病发生发展过程中的精细调控网络，并可能指导药物开发和疾病诊治。
基因芯片作为一种成熟可靠的高通量实验筛选工具，是医学ceRNA研究的首选工具。

技术优势

更适合检测微量样本
特异性检测血清、血浆、外泌体等微量特殊样本中lncRNA和circRNA，避免rRNA或外源性序列干扰。

更全面的circRNA信息
涵盖截至2017年11月全球主流数据库中的circRNA序列88701条，并进行了细致注释。

更适合检测lncRNA
芯片比测序更适合检测低表达丰度的lncRNA分子。

更丰富的芯片实验经验
拥有超过十年的芯片实验经验，轻松应对各种来源的样本。

更系统的实验服务
筛选出候选lncRNA和circRNA后，配套丰富的lncRNA功能验证实验服务。

芯片信息

物种	人类
规格	4x180k
检测circRNA数目	88701
检测lncRNA数目	50433
检测mRNA数目	26083
探针长度	60nt
序列来源	7个数据库（更新至2017.11）：GENCODE、Ensembl、UCSC、Refseq、LNCipedia、Cirbase

技术路线

样本RNA制备及定量检测
荧光标记
探针杂交
图像扫描
数据分析

样本类型

微量样本
血清、血浆：建议1 mL以上
外泌体：建议从5 mL以上血清分离，从20 mL以上尿液分离，其他类型体液请询问

常规样本：
Total RNA：建议2 μg，最低起始量1 μg
组织样本：建议100 mg（湿重）以上
细胞样本：5×10⁶个细胞

结果展示

circMTO1吸附miR-9参与肝癌发展

1.样本来源
289例HCC和癌旁样本（7对样本用于芯片检测）

2.技术手段
circRNA芯片、circRIP（circRNA pull down）、FISH 、IHC、qPCR

为了进一步验证，研究者在261例HCC患者的样本中检测其表达量，发现circMTO1在87.4%（228例）的样本都是低表达的

收集116例HCC患者的生存期数据，通过在组织芯片上做原位杂交（ISH），发现circMTO1在这些样本中依然是显著下调，并且circMTO1的下调与HCC患者的不良预后显著相关

通过MiRanda 预测，有99个miRNA可能是circMTO1的靶标。利用RNA in vivo precipitation（RIP）检测到20个miRNA。其中miR-9与circMTO1共特异性富集。通过FISH发现circMTO1与miR-9共定位于胞浆中，以上的实验结果表明，circMTO1与miR-9在胞浆中结合。

细胞实验表明：HepG2和 SMMC-7721细胞中，沉默circMTO1表达会促进细胞的增殖及其迁移并抑制凋亡；QGY-7701和SK-Hep1 HCC细胞中过表达circMTO1则会促使细胞凋亡；沉默circMTO1或者过表达miR-9，都会使p21的mRNA和蛋白表达水平降低，而过表达circMTO1则会其相反的结果；抑制miR-9的表达可以明显减弱在circMTO1表达下调时介导的对p21蛋白及其mRNA水平的表达抑制效果。也可以阻断circMTO1沉默介导的细胞增殖和抑制凋亡的作用。

成瘤实验结果表明：皮下移植人类HCC组织构建HCC裸鼠移植瘤动物模型（SMMC-LTNM）；circMTO1 沉默（siRNA）两周后，小鼠的肿瘤生长速度明显加快，血清AFP升高；体内敲低（knock down） circMTO1后，p21和下游的CDK2表达被抑制，细胞迁移和扩散的标记物MMP2和PCNA表达上调。

结果展示

1.主成分分析(PCA)
通过 PCA 分析，考察样品的分布情况，验证实验设计的合理性，生物学重复样品的均一性，用二维图展示。同组的样品在二维空间分布比较集中，说明这些基因选取具有代表性，生物学重复好。

2.差异 lncRNA 表达水平聚类分析
差异 lncRNA 表达水平聚类分析, 至尊国际·(中国)至尊服务,至尊享受采用 log10(norm 值)进行lncRNA 表达量展示。同时也可以将差异lncRNA 的 norm 值通过Z 值方式进行展示。其中横坐标为样本，纵坐标为基因，不同的颜色表示不同的基因表达水平，颜色由蓝色至红色表示表达量从低到高。红色表示高表达基因，蓝色表示低表达基因。

3.互作网络分析
使用 Perl 或 Python 等脚本语言构建三种 RNA （mRNA-miRNA-ncRNA(lncRNA,circRNA)）之间的关系。利用 Cytoscape软件，针对三种 RNA 之间的关系，构建出ceRNA network 网络关系图。

常见问题

1.为什么芯片更适合检测微量特殊样本（如血清、血浆、外泌体）的lncRNA或circRNA？
微量样本不适合做核糖体RNA（rRNA）去除。如采用测序，则经过PCR扩增得到文库中绝大部分都是rRNA序列，lncRNA和circRNA序列占比很少；而芯片采用特异性探针检测，则不会受到rRNA的干扰。芯片实验采用线性序列扩增，不会出现测序文库扩增的序列偏好性。微量样本中，即使出现微量的外源性序列干扰，则测序文库扩增时会被显著放大，影响后期的序列分析；而芯片采用特异性探针检测，则不会受到此种干扰。因此，推荐lncRNA芯片或ceRNA芯片进行血清、血浆、外泌体等特殊样本的lncRNA或circRNA检测。

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