circRNA测序

　　环状RNA（circular RNAs，circRNAs），广泛存在于人和动植物中，是一类新的隐秘未知但却功能异常强大的非编码RNA。不同于线性RNA，circRNAs呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。这种特性，预示circRNAs有巨大潜力成为新的临床诊断标志物。最近研究证实，circRNAs是ceRNA调控网络中的重要成员，可以像“海绵”一样大量吸附miRNAs，进而调控基因表达。

技术优势

文库优化：采用核糖体去除、链特异性文库构建、以及RNase R消化方案，既能获取完整的环状RNA和线性RNA序列，也可以仅保留环状RNA序列。
分析全面：全面分析和鉴定样本环状RNA和长链线性RNA（包括mRNA和lncRNA）。
方案多样：从circRNA发掘与表达分析，环状RNA与长链线性RNA互作分析，到ceRNA调控机制解析，由研究人员自由选择研究方案。

技术路线

样本总RNA
核糖体去除
dUTP链特异性文库构建
上机测序(HiSeq 4000，PE150)
数据分析

数据分析

Total RNA
核糖体去除
RNase R处理
dUTP链特异性文库构建
上机测序(HiSeq 4000，PE150)
数据分析

芯片信息

核糖体去除法	核糖体去除+RNaseR处理法
1.原始数据产出统计与预处理	1.原始数据产出统计与预处理；
2.与参考基因组比对	2.与参考基因组比对；
3. circRNA表达谱分析：circRNA鉴定;circRNA注释;circRNA表达与差异分析;差异circRNA-hosting基因GO与KEGG富集性分析;circRNA起源分析;circRNA-miRNA互作网络分析	circRNA表达谱分析：circRNA鉴定；circRNA注释；circRNA表达与差异分析；差异circRNA-hosting基因GO与KEGG富集性分析；circRNA起源分析；circRNA-miRNA互作网络分析。
4. mRNA表达谱分析：mRNA表达与差异分析；差异表达mRNA的GO与KEGG富集性分析；SNP和InDel分析；可变剪切分析；DEU分析；
5. lncRNA表达谱分析：lncRNA鉴定与功能注释；lncRNA与mRNA结构特征比较；lncRNA表达与差异分析；采用cis和trans两种方式预测lncRNA调控的靶基因；对差异表达lncRNA的靶基因进行GO和KEGG富集性分析；特异lncRNA与mRNA网络互作分析。

样本类型

细胞，组织，全血，血清，血浆，总RNA等
建议总RNA起始量：10 μg，最低5 μg，浓度≥200 ng/μL

近期用户文章

1. Shen Y, Guo X, Wang W. (2016) Identification and characterization of circular RNAs in zebrafish. Febs Letters, 591.
2. Zhao W, Cheng Y, Zhang C, et al. (2017) Genome-wide identification and characterization of circular RNAs by high throughput sequencing in soybean. Sci Rep.
3. Li H, et al. (2017) CircFUT10 reduces proliferation and facilitates differentiation of myoblasts by sponging miR-133a. J Cell Physiol. doi: 10.1002/jcp.26230.
4. Wei XF，et al. (2017) Circular RNA profiling reveals an abundant circLMO7 that regulates myoblasts differentiation and survival by sponging miR-378a-3p. Cell Death and Disease . doi:10.1038/cddis.2017.541.

案例展示

circRNA和母基因通过不同的pathway影响肝癌细胞的生长，迁移和侵袭

1.研究背景
肝细胞癌（HCC）是最常见的一种恶性肿瘤，同时，中国也是肝癌的癌症大国。虽然现在的医疗诊断技术发展很快，但是，对与肝癌的现有诊断技术还是受限很大。因此，开发新的诊断biomarker，并理解这些biomarker的作用机制，是很多科研人员想做的事情。本研究从circRNA，一类非常适合做biomarker的候选分子出发，深入研究了一个锌指家族基因ZKSCAN1及其产生的circZKSCAN1，在HCC中的作用机制及作为biomarker的潜在价值。

2.研究结果
1)基因表达模式分析
ZKSCAN1，是一个锌指蛋白家族，该家族基因在肿瘤发生，发展，转移和药物耐受方面都发挥着非常重要的作用。同时，现有的研究也发现，ZKSCAN1基因的第二个和第三个外显子部分能形成一个circRNA，在人脑部和肝脏表达丰富。因此，研究人员首先验证了ZKSCAN1和circ ZKSCAN1在HCC组织中的表达情况。102个HCC组织和配对癌旁的RT-PCR结果显示，他们在HCC样本中的表达显著降低。进一步将ZKSCAN1和circ ZKSCAN1的表达与临床指标进行关联分析，发现低的ZKSCAN1表达与肿瘤大小显著相关；而circ ZKSCAN1的表达与不同肿瘤数目，硬化程度，血管侵袭，微血管侵袭，肿瘤grade都显著相关。ROC曲线分析显示，circ ZKSCAN1的AUC值达到0.834，敏感性和特异性能达到82.2%和72.4%，相比而言，ZKSCAN1的AUC值只有0.474。因此，circ ZKSCAN1的表达更合适作为肿瘤组织的诊断biomarker。

2)circRNA与母基因表达相关性分析
对于circRNA的研究，第一个想到的是circRNA的表达是否会和母基因表达有关联。因此，研究人员先在不同人HCC细胞系中检测了ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表达。发现所有的细胞系（Huh7, SMMC-7721, BEL-7402, HepG2和HepG3B）相比对照组（L02），表达都降低。通过在HepG2和SMMC7721中过表达和敲降ZKSCAN1和circZKSCAN1，研究人员发现过表达或者敲降其中一个，不会影响另一个的表达变化。因此，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表达彼此独立，不相互影响。

3)基因功能分析
为探究ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1对HCC细胞的功能影响，研究人员进行了相关检测。结果显示，在ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的敲降细胞中，增殖能力显著增强，而过表达细胞中，显著下降；过表达细胞的迁移和侵袭能力显著降低；敲降细胞显著增加。进一步的裸鼠种植实验也表明，过表达时肿瘤生长抑制，而敲降时刺激肿瘤生长。因此，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1对肿瘤生长有显著影响。

4)基因亚细胞定位
基因在细胞中的定位往往决定着他们的功能行使。因此，研究人员对ZKSCAN1的蛋白进行亚细胞定位。结果显示，正常肝组织的细胞质中存在大量的ZKSCAN1，而HCC肝组织中却很少。另外，FISH分析表明circ ZKSCAN1也是主要定位于细胞质中。

5)下游调控基因分析
为探究ZKSCAN1调控细胞增殖和侵袭的内在分子机制。研究人员对敲降ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1的HCC细胞与对照进行了全基因组RNA测序。结果显示，敲降circZKSCAN1引起372个基因差异表达；敲降ZKSCAN1引起346个基因差异表达。其中，两组结果中共有166个是在两种情况下都出现差异。KEGG通路分析显示，敲降circ ZKSCAN1的差异基因富集到PI3K pathway, migration pathway, actin cytoskeleton pathway等；而敲降ZKSCAN1则主要富集到metabolic pathways。因此，circ ZKSCAN1和ZKSCAN1影响了下游不同的信号通路影响细胞增殖和侵袭。

6)qRT-PCR验证下游基因
最后，研究人员对特异性地在ZKSCAN1敲降后变化的基因与circZKSCAN1敲降后变化的基因及都变化的基因进行了qRT-PCR验证，结果表明，在ZKSCAN1敲降后，细胞代谢相关基因确实发生了显著变化；而在circZKSCAN1敲降后，凋亡和迁移相关基因发生显著变化；COL3A1，CDH5，MYB，PDK1和BCL2在两种情况下都显著变化。

研究结论

在本研究中，研究人员发现，虽然ZKSCAN1和circRNA在HCC中都发生了显著下调，都是影响细胞生长，迁移和侵袭，但是，他们影响的下游信号通路却是各不相同。该研究为理解circRNA和其母基因在生命体中的调控作用提供了新的依据。

参考文献

Yao Z, Luo J, Hu K，et al.（2017）ZKSCAN1 gene and its related circular RNA (circZKSCAN1) both inhibit hepatocellular carcinomacell growth, migration and invasion but through different signaling pathways. Mol Oncol. doi: 10.1002/1878-0261.12045

结果展示

1.基因表达值密度
不同样本各自表达量处理后数值log10（fpkm）做表达值密度图，可以比较不同样本间表达趋势的变化。理想状态下，各样本的表达密度图应符合正态分布，同时生物学重复样本的表达趋势应趋于一致。

2.差异circRNA-hosting gene GO富集性柱状图
GO富集性分析结果柱状图反映在生物过程(biological process)、细胞组分 (cellular
component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差异基因的个数分布情况。

3.差异circRNA-hosting gene KEGG富集性散点图
通过ggplot2对KEGG富集分析结果以散点图的形化进行展示，其中横坐标Rich factor表示位于该KEGG的差异基因个数/位于该KEGG的总基因数（Rich factor=S gene number/B gene number），Rich factor越大，KEGG富集程度越高。纵坐标是Pathway term，即KEGG代谢通路。散点图中，点的大小代表 S gene number 匹配到单个KEGG的具有显著性差异的基因数，点的颜色代表富集分析的p值，即富集的显著性。KEGG富集分析散点图是根据富集的显著性（pvalue）取top20的Pathway term进行绘图。

常见问题

1.CircRNA的成环机制都有哪些？
CircRNA的成环机制有：套索驱动的环化；内含子配对驱动的环化；内含子环化；RBP或一类反式因子驱动的环化；可变剪接引起的环化。

2.circRNA测序和普通的RNA-seq，在抽提total RNA时有区别吗？
circRNA测序对total RNA的要求与普通的RNA-seq相同，所以抽提方法也相同。但是由于circRNA建库需要去除rRNA和线性RNA，所以需求大量的total RNA，需提供大于等于10 μg的total RNA。

3.circRNA与lncRNA的区别是什么？
结构上，circRNA没有自由的5’端和3’端；功能上， circRNA功能研究比较单一，现在对于其是否能够像lncRNA一样在染色体水平、蛋白质水平上具有调控作用，尚未可知，这些也是现在研究的方向。根据已有研究发现， circRNA可以发挥海绵效应吸附miRNA，可以作为竞争性内源RNA。

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